¿Por qué es necesario hacer un corte muy fino para observar en el microscopio óptico?
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Respuesta:
Para la observación con detalle de la ultraestructura celular es necesario realizar secciones muy delgadas, del orden de nanómetros, denominadas ultrafinas, y observarlas con el microscopio electrónico de transmisión. Para ello se incluye la muestra en resina, generalmente de tipo epoxy, que una vez polimerizada resulta en un bloque de gran dureza. La obtención de secciones ultrafinas se lleva a cabo con un aparato denominado ultramicrotomo (Figura 1). Otra manera menos habitual de obtener secciones ultrafinas es mediante el ultracriotomo, para lo cual la muestra se congela y se corta en una cámara refrigerada a muy bajas temperaturas. Este último es un mecanismo similar al visto para el criostato. Es un aparato que sólo se usa cuando queremos detectar con microscopía electrónica moléculas que son dañadas durante el proceso de inclusión.El ultramicrotomo tiene un diseño para hacer secciones de un modo similar al microtomo de parafina de rotación, pero mucho más preciso y sofisticado. Quizá el sistema más delicado sea el que hace avanzar el bloque sobre la cuchilla pues debe hacerlo a intervalos de varios nanómetros. Actualmente este sistema de avance es mecánico pero en los ultramicrotomos más antiguos era por calor, que producía dilatación del eje sobre el que se sujetaba la muestra. También tiene un sistema completo de orientación de la muestra sobre el borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la superficie de nuestra muestra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vibración o cambio de temperatura afecta la homogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe situarse en una habitación donde no haya vibraciones y mantenerla a temperatura constante para evitar dilataciones del brazo que porta la muestra, dentro de lo posible. Además, estos aparatos se colocan sobre mesas especiales para disminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde se controla electrónicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de la sección, velocidad de corte, ventana de corte, iluminación de la muestra, etcétera.
Antes de realizar el primer corte ultrafino de una muestra, al igual que ocurría con los cortes de parafina, es necesario retallar y desbastar el bloque para crear una pirámide truncada. Aunque todo este proceso se puede hacer a mano con una cuchilla, se suele utilizar un aparato denominado piramidotomo con el que se liman y crean las caras de la pirámide con un dispositivo a modo de torno, además de producir el desbastado para obtener la superficie de corte. Hay que tener en cuenta que este proceso ha de ser preciso porque la superficie de corte debe ser muy pequeña, en torno a unos 0,5 mm2. Los lados de la superficie de corte deben ser similares a los descritos para el corte en inclusiones de parafina, dos lados han de ser paralelos y uno más grande que el otro. Con esto nos aseguramos que una nueva sección empujará a la previa del borde de la cuchilla y que conseguiremos tiras rectas de secciones. Antes de hacer las secciones ultrafinas se suele hacer una sección semifina, de 0,5 o 1 µm para observar una imagen de la muestra al microscopio óptico.
Las cuchillas empleadas para hacer secciones ultrafinas son específicas para este tipo de aparatos puesto que han de tener unos filos muy agudos. Las más comúnmente usadas son de vidrio especial y se obtienen mediante unos aparatos que mediante ralladuras con puntas de diamante y golpes secos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas (Figura 2). Sin embargo, la mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con filo de diamante, pero son mucha más caras. Aunque los ultramicrotomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. El grosor de una sección ultrafina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro pálido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), púrpura (150 a 190 nm), etcétera.
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