dominio catalitico de las glucoamilasas
Respuestas a la pregunta
La glucoamilasa es una enzima hidrolítica del grupo de las amilasas, también conocida como amiloglucosidasa, su nombre sistemático es 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa (EC 3.2.1.3). Es una de las enzimas más estudiadas debido a su influencia directa en la degradación del almidón, uno de los productos alimentarios más explotados a nivel mundial.
Las cadenas de almidón están compuestas por dos grandes sub-cadenas, amilosa y amilopectina. La función de la glucoamilasa es actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de polisacáridos rompiendo los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa que se encuentran de manera residual en las cadenas después de haber sido digeridas por alfa y beta amilasas. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es glucosa, lo que la diferencia de la alfa y beta amilasas.
Su actividad es máxima entre pH 4 - 5,5 y temperatura alrededor de 55ºC - 65ºC, es producida extracelularmente por numerosos tipos de hongos y algunas bacterias, aunque la principal fuente de esta enzima son los hongos filamentosos donde destaca el género Aspergillus. También se han utilizado algunos cultivos de bacterias (Bacillus coagulans y Lactobacillus brevis) y levaduras (Saccharomyces cerevisiae y Sacharomycopsis figuligera) aunque la baja producción dificulta su comercialización.
Aplicaciones de la glucoamilasa
Interviene en los pasos de sacarificación de:
Producción de energía: se utiliza para la producción de etanol.
Conversión enzimática del almidón: se utiliza junto con la alfa amilasa para la conversión industrial del almidón a glucosa.
Las amilasas han sido de gran importancia en diversas industrias durante las últimas décadas debido a la utilización de las técnicas biotecnológicas basadas en enzimas, optimizando así el proceso de degradación del almidón. Las amilasas ocupan cerca de un 25% en el mercado enzimático llegando a sustituir completamente procesos de hidrólisis química en la industria del almidón debido fundamentalmente a su termoestabilidad y a que la hidrólisis se lleva a cabo en un único paso.
Proceso de hidrólisis
La hidrólisis del enlace glicosídico tiene lugar mediante una catálisis ácida que requiere la actuación de dos residuos localizados en el centro activo del enzima, en la mayor parte de los casos aspártico o glutámico. Uno de ellos actúa como donador de un protón y el otro como nucleófilo/base. Esta hidrólisis puede ocurrir a través de dos mecanismos diferentes que dan como resultado la retención o la inversión de la configuración del carbono anomérico. La disposición espacial y distancia entre los residuos catalíticos es diferente según sea el mecanismo de hidrólisis del enlace.
Genes de la glucoamilasa
Saccharomyces cerevisiae presenta tres genes distintos, no ligados, STA1, STA2 y STA3 que codifican formas idénticas de glucoamilasa denominadas GAI, GAII y GAIII. Además de la glucoamilasa codificada por estos genes STA, existe otra forma de la enzima codificada por el gen SGA1 (Sporulationspecific glucoamylase), producida durante los procesos de meiosis y esporulación, la cual es responsable de la degradación del glucógeno intracelular. El péptido señal necesario para la secreción de la enzima se encuentra en la zona 5 de los genes STA la cual es una zona rica en serina y treonina.
Estructura tridimensional de la glucoamilasa
La mayoría de las glucoamilasas son enzimas multidominio, es decir, están constituidas por un dominio catalítico (CD, catalytic domain) unido, mediante una región glicosilada de longitud variable, a un dominio de unión al almidón (SBD, starch binding domain). La glucoamilasa de S.cerevisiae se caracteriza por poseer un dominio rico en serina y treonina en lugar de un dominio de unión al almidón en su región amino terminal.
La mayoría de los dominios catalíticos de las glucoamilasas presentan una arquitectura similar que comprende como mínimo doce hélices alfa, apareadas dos a dos formando un barril (/)6. En el CD existen regiones muy conservadas de la secuencia que comprenden bucles o loops que rodean al centro activo. Estos bucles, que carecen de estructura secundaria definida, se han relacionado con la estabilidad y especificidad de substrato.
Una característica muy importante, desde el punto de vista funcional de las glucoamilasas de levadura es la ausencia del SBD. La falta de este dominio no reduce la eficacia de los enzimas cuando actúan sobre el almidón soluble y varios estudios han confirmado la importancia de este elemento en la degradación de moléculas grandes de almidón insoluble.
Las glucoamilasas presentan múltiples sitios de N-glicosilación pero sólo tres aparecen conservados en distintas subfamilias. Estos están localizados en los loops del CD de la cadena polipeptídica desprovistos de estructura secundaria. Los carbohidratos asociados a glucoamilasas parecen tener un efecto estabilizador que además dirigen el correcto plegamiento de la proteína.
Determinación de la actividad de la glucoamilasa.
Para saber si realmente hay cambios significativos respecto a la glucoamilasa nativa y las diferentes variedades mutantes se ha de determinar su actividad. El método semicuantitativo consiste en observar halos de hidrólisis alrededor de las colonias transformadas sembradas en placas con 1% de almidón insoluble en el medio. El método cuantitativo consiste en medir la cantidad de glucosa liberada a partir de alimón soluble al 0,5%, almidón insoluble o pululano al 1%.
Al final, todas las estirpes transformadas con el plásmido pS2 presentan actividad glucoamilasa.
Esta actividad glucoamilasa detectada en las estirpes estudiadas es un reflejo de los niveles de expresión del gen STA1, de forma que a mayor expresión del gen, mayor actividad glucoamilasa.
Una vez determinada la actividad del enzima se procede a generar diversos mutantes.